概要：脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）是一種具有均勻脂質(zhì)核的脂囊泡，被廣泛應(yīng)用于小分子藥物和核酸輸送，最近因?yàn)樵贑OVID-19 mRNA疫苗遞送平臺(tái)取得的顯著成功引起了廣泛的關(guān)注。然而，mRNA誘導(dǎo)的短暫蛋白表達(dá)的應(yīng)用并不僅僅用于傳染性疾病的疫苗領(lǐng)域，也為癌癥疫苗、蛋白質(zhì)替代療法和罕見(jiàn)遺傳疾病的基因編輯組件提供了新的途徑。然而，未包覆的mRNA本身并不穩(wěn)定，很容易由于核酸酶和自水解快速降解。經(jīng)LNPs包覆的mRNA可以免受細(xì)胞外核糖核酸酶的影響，并有助于細(xì)胞內(nèi)mRNA的遞送。在這篇文章中，我們將討論RNA遞送所使用LNPs的核心特征。本文將聚焦于mRNA遞送用LNPs；然而，也相應(yīng)地列舉了siRNA-LNP遞送的例子，以突出核酸結(jié)構(gòu)造成的共性和差異。首先，將介紹LNPs的概念，利用核酸作為治療藥物的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及LNPs分子構(gòu)成的一般推理；同時(shí)簡(jiǎn)要介紹了臨床上基于LNPs的核酸治療的最新成功經(jīng)驗(yàn)。其次，闡述了LNP自組裝的理論和方法。所有制備方法的共同理念是誘導(dǎo)核酸和帶電脂質(zhì)之間的靜電相互作用，并通過(guò)疏水作用促進(jìn)納米顆粒的生長(zhǎng)。第三，根據(jù)基本性質(zhì)和用途對(duì)LNP進(jìn)行成分分解，包括公認(rèn)的分子設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)、商業(yè)來(lái)源，對(duì)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊?，以及?duì)LNPs性能的貢獻(xiàn)。LNPs的關(guān)鍵成分之一是啟動(dòng)與內(nèi)吞體膜的靜電結(jié)合、并促進(jìn)胞質(zhì)釋放的可電離脂質(zhì)；然而，其他脂質(zhì)成分的作用也不應(yīng)忽視，因?yàn)樗鼈兣cLNPs的穩(wěn)定性、間隙和分布密切相關(guān)。第四，從整體上回顧了對(duì)RNA遞送有重要影響的LNP結(jié)構(gòu)屬性，包括LNP的尺寸、電荷、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)封裝、脂膜水合作用、穩(wěn)定性和對(duì)生物大分子的親和性；還將討論這些屬性的檢測(cè)技術(shù)以及調(diào)控方法。最后，展望了RNA療法的未來(lái)，并提出了LNP配方和優(yōu)化領(lǐng)域中存在的一些問(wèn)題。

 

1.引言

近年來(lái)，脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）顯示其在RNA疫苗和療法中作為遞送系統(tǒng)的的實(shí)用性。無(wú)包覆的RNA是一種帶負(fù)電荷的親水大分子，由于細(xì)胞膜的靜電排斥，很難進(jìn)入細(xì)胞，并被無(wú)所不在的核糖核酸酶（RNase）迅速降解。因此，它需要一個(gè)保護(hù)層以增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部機(jī)會(huì)。由于細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)構(gòu)成，因此，使用脂質(zhì)體包覆RNA可以使RNA更容易通過(guò)細(xì)胞膜并將其釋放到細(xì)胞質(zhì)中。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，脂質(zhì)體首先需要一個(gè)帶正電的脂粒，可以附著在帶負(fù)電的RNA上。然而，由永久性陽(yáng)離子脂粒組成的脂質(zhì)體會(huì)對(duì)帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電破壞從而引起細(xì)胞毒性。因此，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步改進(jìn)，通過(guò)酸性內(nèi)溶酶體途徑獲得正電荷；LNP成分也擴(kuò)展到了結(jié)構(gòu)脂類（模擬細(xì)胞膜并屏蔽正電荷）和聚（乙二醇）-錨定脂類（防止LNPs聚集以及與生物環(huán)境的副反應(yīng)）。從FDA批準(zhǔn)了首個(gè)siRNA-LNP藥物（Onpattro）和mRNA-LNP新冠疫苗（Comirnaty）以及Moderna新冠疫苗的緊急使用授權(quán)（EUA）等這些該領(lǐng)域的主要監(jiān)管里程碑事件可以明顯看出，基于LNP的核酸遞送方法是安全的，適用于各種療法。然而，目前還沒(méi)有適合所有疾病的萬(wàn)能方案，因此LNP的優(yōu)化工作依舊任重道遠(yuǎn)。本文將討論用于選擇RNA-LNP遞送脂類所需的主要科學(xué)和制造概念。

2.制備

LNP的制備依賴于自組裝能力，即脂質(zhì)成分在分子間相互作用的基礎(chǔ)上自發(fā)組裝成納米實(shí)體。LNP的形成從帶負(fù)電荷的核酸和帶正電荷的脂類之間的靜電結(jié)合開(kāi)始。然后，LNPs通過(guò)疏水性和脂質(zhì)組分之間相互作用的范德華力增長(zhǎng)。由于脂質(zhì)的多樣性、核酸的獨(dú)特性及兩者混合過(guò)程的瞬時(shí)性，對(duì)自組裝的早期階段及其對(duì)LNP最終性質(zhì)的相關(guān)影響的表征仍然極具挑戰(zhàn)。此外，LNP制造協(xié)議至少在兩個(gè)方面影響產(chǎn)品的自組裝: LNPs的均勻性和核酸負(fù)載效率。

LNP有多種制備方法，如脂膜泡擠出法、脂膜再水化、納米沉淀法和微流體混合法。然而，通常的制備方法是將水和脂質(zhì)組分快速混合。微流控技術(shù)以其良好的重復(fù)性而成為當(dāng)前臨床前研究的首選方法。新型微流控設(shè)備制造取得的進(jìn)展使這種方法更容易實(shí)現(xiàn)，采用平行微流體通道或改進(jìn)的傳統(tǒng)方法（如移液管混合和t型混合器）等其他途徑也可以實(shí)現(xiàn)LNPs的高通量制備。一般來(lái)講，微流體混合有利于將親水性部分封裝到疏水的脂質(zhì)核心中，但這一過(guò)程并不能嚴(yán)格需要核酸的參與。Kulkarni等報(bào)道，只要脂質(zhì)核心形成，LNPs可以在T型混合器內(nèi)與siRNA完成組裝?？偟膩?lái)說(shuō)，混合方式的特性可能會(huì)影響LNPs的組裝效率和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而自組裝過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因數(shù)則會(huì)決定最終的納米結(jié)構(gòu)。

3.配方

3.1陽(yáng)離子和可電離脂質(zhì)

陽(yáng)離子脂質(zhì)（CLs）和可電離脂質(zhì)（ILs）通過(guò)靜電相互作用啟動(dòng)自組裝的第一步。含有CLs的脂質(zhì)體仍被廣泛用于核酸遞送。然而，由于毒性問(wèn)題和缺乏體內(nèi)療效，它們已被對(duì)pH敏感的ILs所取代。當(dāng)被配制成LNPs時(shí)，ILs被設(shè)計(jì)成在生理pH下顯示電中性，但在酸性核內(nèi)體內(nèi)則表現(xiàn)為帶正電荷。這種pH適應(yīng)的電離性使其功效提升同時(shí)毒性降低，從而更適合于核酸遞送。這些脂類通常占配方中總脂類的30-50%。許多研究致力于微調(diào)ILs的屬性，以進(jìn)一步提高效率，特別是在難以觸及的組織。CLs和ILs的整體結(jié)構(gòu)可以分為三個(gè)部分：（1）頭基、（2）連接體及（3）尾部（圖1）。

圖1 CLs和ILs結(jié)構(gòu)及組件（頭基、連接體及尾部）示意圖

頭基 ILs的頭基通常帶正電荷。頭基的大小和電荷密度對(duì)核酸包覆、LNP穩(wěn)定、與細(xì)胞膜相互作用以及促進(jìn)核內(nèi)體中的釋放有重要作用。ILs也可能有多個(gè)可電離的頭基，盡管通常情況下只有一個(gè)。典型的基包括胺（從一級(jí)到四級(jí)）、胍和雜環(huán)群 （見(jiàn)圖1）。臨床應(yīng)用的ILs（DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-0315；見(jiàn)圖2）包含具有pH適應(yīng)電離性的叔胺頭基。ALC-0315和SM-102頭基中也含有末端羥基，可以減少頭基的水合作用，并提高其與核酸的氫鍵作用，可能會(huì)提高轉(zhuǎn)染能力。

圖2 特定ILs結(jié)構(gòu)及cpKa和cLogP值

 

連接體 連接體通常連接頭基與尾部，也可能包含在尾部?jī)?nèi)（SM-102和ALC-0315；見(jiàn)圖2）。連接體會(huì)影響LNPs的穩(wěn)定性、生物降解性、細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率。在CLs和ILs設(shè)計(jì)中使用的常用連接器如圖1所示。ILs可能包含一個(gè)或多個(gè)連接體；然而，為了便于合成，大多數(shù)ILs只含有一種類型的連接體。連接體可分為不可生物降解型（如醚類和氨基甲酸酯類）和可生物降解型（如酯類、酰胺類和硫醇類）。生物可降解連接體由于可在體內(nèi)被快速清除，通常被作為首選，以確保多次給藥并減少潛在的副作用。值得注意的是，DLin-MC3-DMA，ALC-0315和SM-102都含有酯類連接體。對(duì)于SM-102，酯基團(tuán)周圍的修飾被證實(shí)會(huì)影響LNPs的清除、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。

尾部 疏水性的尾部會(huì)影響pKa、親脂性、流動(dòng)性和融合性，從而影響納米顆粒的形成和效力。通常，一個(gè)IL包含1到4個(gè)由8到20個(gè)碳原子組成的飽和或不飽和的疏水性尾部。不飽和程度已被證明通過(guò)調(diào)節(jié)膜不穩(wěn)定相關(guān)方面影響核酸的遞送。DLin-MC3-DMA有兩條亞油基尾部，而ALC-0315和SM-102包含兩個(gè)假定為錐形的分叉飽和尾部，有助于對(duì)核內(nèi)體膜的去穩(wěn)定作用和核酸在細(xì)胞溶質(zhì)的釋放。

ILs可以被看作是多組分分子，其中的每個(gè)部分都需要被精確設(shè)計(jì)，以便安全、高效地包覆和遞送核酸。從整體上理解ILs的特性也有助于設(shè)計(jì)下一代ILs。這些性質(zhì)之一是計(jì)算出的ILs的pKa（cpKa），可以很容易地在硅中確定。常見(jiàn)ILs的cpKa值在9到10.5之間（圖2）。最近的一項(xiàng)研究表明，cpKa極度接近IL的實(shí)際pKa. ILs的cpKa似乎影響相應(yīng)LNP配方的整體pKa，這樣當(dāng)IL 的cpKa大約是8.5−10.5時(shí)，LNP的pKa值約為6−7。IL的cpKa和LNP的pKa之間的差值似乎是固定的，約等于2 - 4個(gè)單位。因此，cpKa可以作為新ILs產(chǎn)品設(shè)計(jì)的指導(dǎo)工具。ILs的另外兩個(gè)不太被關(guān)注的性質(zhì)是cLogP和cLogD值，它們分別代表分子在非電離態(tài)和電離態(tài)下的親油性。在最近的一項(xiàng)研究中，Rajappan等考察了pKa、cpKa和cLogD對(duì)LNPs遞送siRNA的影響，發(fā)現(xiàn)cLogD在10 - 14范圍內(nèi)的脂質(zhì)效果最好。因?yàn)橐恍┏Ｒ?jiàn)的ILs的cLogP值在15−20范圍內(nèi) （圖2），在設(shè)計(jì)下一代ILs時(shí)也應(yīng)考慮其親油性性。由于電離度（cpKa）和親油性（cLogP） IL可以影響從最初的與核酸形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)到最終納米粒子形成以及核酸遞送的整個(gè)流程，在合成IL前同時(shí)考慮這兩個(gè)參數(shù)可能會(huì)極大的推動(dòng)高效IL的發(fā)現(xiàn)。不過(guò)，需要更多的研究來(lái)印證這一觀點(diǎn)。

除了傳統(tǒng)的CLs和ILs外，還有一些兩性離子脂類的例子。在最近的一項(xiàng)研究中，Liu等人合成了一個(gè)名為iPhos的超過(guò)500種兩性離子脂質(zhì)的庫(kù)。這些iPhos由一個(gè)胺基、短疏水性尾部和一個(gè)磷酸鹽連接體組成。研究認(rèn)為，帶負(fù)電荷的磷酸基促進(jìn)了膜融合，并導(dǎo)致核內(nèi)體釋放。最優(yōu)的9A1P9的各種配方可以優(yōu)先將目標(biāo)核酸輸送到肝臟和肺部。

綜上所述，ILs各部分的性質(zhì)影響整體配方和生物學(xué)特性。過(guò)去50年間，為設(shè)計(jì)出理想的IL已經(jīng)有了許多系統(tǒng)的研究。其中一些ILs已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于基因制劑的遞送。然而，設(shè)計(jì)能夠在非肝靶上高效無(wú)毒地輸送不同類型的基因制劑的ILs仍需大量研究。對(duì)ILs合成有更多興趣的讀者可以參考一篇優(yōu)秀的相關(guān)綜述。

 

3.2固醇類

圖3 LNP配方中使用的固醇（綠色）、磷脂（藍(lán)色）和PEG脂質(zhì) （紅色）舉例

3.3磷脂類

磷脂有助于核酸的封裝和LNPs穩(wěn)定性的提高。與其他脂類成分相比，它們的研究相對(duì)較少，通常只占配方中總脂類的10 - 20%。磷脂因?yàn)榭梢宰园l(fā)地組織成脂質(zhì)雙分子層，并且具有較高的相變溫度從而確保LNPs的膜穩(wěn)定性而被用作結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。磷脂位于LNPs的外圍，就像細(xì)胞膜一樣。這些脂類通常是半合成的，例如，磷脂酰膽堿通常來(lái)自蛋黃和大豆等天然來(lái)源，可以通過(guò)化學(xué)修飾使其包含脂肪酸尾部。二硬脂酰磷脂酰膽堿 （DSPC）（見(jiàn)圖3）是一種臨床批準(zhǔn)的LNPs結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，用于如siRNA治療（Onpattro）和針對(duì)SARS-CoV-2的mRNA疫苗。DSPC在結(jié)構(gòu)上由磷脂酰膽堿頭基和兩個(gè)飽和18碳尾組成，形成一個(gè)緊密堆積的脂質(zhì)雙分子層。在LNPs中，它主要位于納米顆粒表面，同時(shí)在納米顆粒核中少量存在。二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）是另一種經(jīng)常用于LNPs臨床前研究的磷脂。由于尾部不飽和，DOPE不僅形成流動(dòng)性更好的脂質(zhì)層，而且具有形成六邊形II （HII）相結(jié)構(gòu)的內(nèi)在能力。HII相結(jié)構(gòu)被認(rèn)為能促進(jìn)脂質(zhì)膜與核內(nèi)體膜的膜融合，進(jìn)而使核酸制劑在胞質(zhì)內(nèi)釋放。多項(xiàng)研究表明，與DSPC相比，DOPE可以提高率磷脂基LNPs中RNA的轉(zhuǎn)染效率。近期，Zhang等人報(bào)道稱，DOPE可導(dǎo)致C12-200 LNPs在肝臟內(nèi)的聚集，而DSPC會(huì)導(dǎo)致靜脈給藥時(shí)脾積聚，證明了結(jié)構(gòu)脂質(zhì)對(duì)LNP生物分布的影響。我們還發(fā)現(xiàn)，用天然糖脂替代MC3基LNPs中的DSPC會(huì)影響mRNA轉(zhuǎn)染，來(lái)自植物的膜脂--高絲氨酸（DGTS）（見(jiàn)圖3），可以根據(jù)給藥途徑表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率?？傊?，這些研究突出了結(jié)構(gòu)脂質(zhì)在LNPs介導(dǎo)的RNA遞送中的重要性。

3.4嵌PEG脂質(zhì)

嵌PEG脂質(zhì)（PEG-lipids，見(jiàn)圖3）是控制LNPs半衰期和細(xì)胞攝入的一個(gè)重要組成部分。在LNP組裝過(guò)程中，PEG鏈由于其親水性和大體積而位于納米顆粒的外殼中。與其他納米載體一樣，PEG為L(zhǎng)NPs提供了外部聚合物層，以阻礙血清蛋白和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的吸附，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。PEG還可以防止納米顆粒在儲(chǔ)存過(guò)程以及血液中的聚集。此外，PEG脂質(zhì)的含量可能決定顆粒的大小。PEG脂質(zhì)的另一個(gè)潛在用途是功能化LNP的表面，使LNPs與配體或生物大分子結(jié)合成為可能。例如，Singh等使用DSPE-PEG-胺通過(guò)NHS/EDC化學(xué)共軛結(jié)合透明質(zhì)酸來(lái)靶向治療腫瘤，Parhiz等使用DSPE-PEG-馬來(lái)酰亞胺通過(guò)SATA-馬來(lái)酰亞胺化學(xué)共軛結(jié)合抗體。雖然PEG有助于LNP的穩(wěn)定性和生物偶聯(lián)，但其解吸對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染也至關(guān)重要。PEG從LNPs中的脫落可使血清蛋白（如載脂蛋白和白蛋白）產(chǎn)生調(diào)理作用，這是LNPs發(fā)生受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用的關(guān)鍵效應(yīng)物。Akinc等人證明ApoE與LNPs結(jié)合后，導(dǎo)致低密度脂蛋白受體（LDLR）介導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)化。由于PEG脂質(zhì)抑制ApoE與LNPs的結(jié)合，過(guò)量的PEG 脂質(zhì)會(huì)對(duì)LNPs的細(xì)胞攝入和轉(zhuǎn)染產(chǎn)生不利影響。含有較少PEG脂質(zhì)的LNPs由于更容易與ApoE結(jié)合表現(xiàn)出更高的酸遞送效率。PEG脂類脂質(zhì)錨的長(zhǎng)度也是決定解吸速率的重要因素。Mui等報(bào)道了PEG從LNP的脫落與PEG-脂質(zhì)錨定長(zhǎng)度成反比，這是因?yàn)镻EG-脂質(zhì)與LNP膜之間的疏水相互作用隨著PEG-脂質(zhì)錨定長(zhǎng)度的增加而增加。Suzuki等提出，PEG脫落的速度也可能影響抗-PEG抗體的產(chǎn)生，并反復(fù)給藥會(huì)引起并發(fā)癥。靜脈給藥LNP配方中PEG脂質(zhì)的含量很少超過(guò)2%；然而，密集的聚乙二醇層可能有利于達(dá)到肝外靶點(diǎn)。Lee等的研究結(jié)果顯示，相較2.5%的PEG脂質(zhì)含量，5%的PEG脂質(zhì)含量時(shí)LNPs在腫瘤中的積累更量高于，Lokugamage等的研究表明，PEG脂質(zhì)對(duì)霧化LNPs的遞送至關(guān)重要。因此，LNPs中PEG脂質(zhì)的含量和種類可能需要根據(jù)臨床需求謹(jǐn)慎調(diào)整。

4.性質(zhì)

LNPs的平均尺寸和尺寸分布是各種應(yīng)用中LNP質(zhì)量和適用性的重要初始決定因素，這些性質(zhì)通常用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）來(lái)研究。一般來(lái)說(shuō)，LNP的最佳尺寸為20 - 200nm，因?yàn)檫@個(gè)尺寸使其在流體（如血液和淋巴）中足夠穩(wěn)定，同時(shí)能夠穿過(guò)間隙。LNP的尺寸通常通過(guò)改變PEG脂質(zhì)的量或混合參數(shù)（如流速和體積比）來(lái)調(diào)節(jié)。LNPs的尺寸可能會(huì)影響其內(nèi)吞、生物分布、降解和清除，不同的應(yīng)用可能需要不同的粒徑。例如，45 nm的siRNA LNPs在皮下給藥時(shí)最有效，而80 nm 的siRNA LNPs在小鼠靜脈給藥時(shí)最有效。然而，對(duì)嚙齒動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中各種粒徑mRNA-LNP的對(duì)比表明，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物肌肉注射時(shí)對(duì)LNPs粒徑不太敏感。

LNP依靠表面電荷與細(xì)胞膜和生物環(huán)境進(jìn)行相互作用。由于細(xì)胞膜帶負(fù)電荷，表面帶負(fù)電荷的LNPs會(huì)被細(xì)胞膜排斥從而不被細(xì)胞吸收。另一方面，帶正電荷LNPs可能會(huì)直接破壞細(xì)胞膜，引起細(xì)胞毒性。這就凸顯了可電離脂質(zhì)在LNP設(shè)計(jì)中的重要性：最初，含有可電離脂質(zhì)的LNP是中性的，可以避免任何不必要的靜電相互作用，但在酸性內(nèi)體pH環(huán)境下會(huì)帶正電荷。LNPs的表面電荷通常用zeta電位測(cè)量來(lái)評(píng)估，該技術(shù)通常用于評(píng)估膠體聚集，盡管沒(méi)有嚴(yán)格的分類，但如果zeta電位落在-20和+20 mV之間，則認(rèn)為表面電荷較弱。調(diào)整LNPs總表面電荷的一種常見(jiàn)方法是調(diào)整N/P比或者說(shuō)電離脂質(zhì)（N代表陽(yáng)離子胺）與核酸（P代表陰離子磷酸鹽）的比值。Carrasco等認(rèn)為，增加含有可電離脂質(zhì)KC2的LNPs中的N/P比可以增加表面電荷和封裝效率。有趣的是，在LNPs中加入永久帶電的脂質(zhì)時(shí)可能在不增加表面電荷的情況下改變優(yōu)先攝取的器官。Cheng等基于脂質(zhì)電荷在小鼠中實(shí)現(xiàn)了選擇性器官靶向（SORT）：向LNP配方中添加帶正電荷的脂質(zhì)可實(shí)現(xiàn)肺組織的優(yōu)先轉(zhuǎn)染，而帶負(fù)電荷的脂質(zhì)則將轉(zhuǎn)染導(dǎo)向脾臟。

脂質(zhì)封包可能會(huì)影響從膜的水化和變形能力到細(xì)胞攝取和核酸釋放等許多參數(shù)。最近的一篇綜述總結(jié)了形成脂質(zhì)囊泡所需的脂質(zhì)體的基礎(chǔ)知識(shí)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，每種脂質(zhì)都可以用一個(gè)封包參數(shù)來(lái)描述，該參數(shù)取決于脂質(zhì)極性“頭”和非極性“尾”所占的體積。結(jié)構(gòu)平衡的脂質(zhì)形成柱狀結(jié)構(gòu)和層狀相，而“不平衡”結(jié)構(gòu)則形成六方、立方和膠束相。倒置的六方相（HII）表現(xiàn)出最顯著的脂膜融合促進(jìn)作用。到目前為止，非層狀相的可控制備在RNA-LNP遞送領(lǐng)域仍然是相對(duì)少見(jiàn)的，納米立方液晶是最突出的例子。然而，LNPs在暴露于環(huán)境誘因時(shí)可能發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。Heyes等利用核磁共振波譜（P NMR）研究了含有一系列具有不同脂尾的陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒的相變行為，發(fā)現(xiàn)層狀到倒置六方相轉(zhuǎn)變溫度（TBH）較低的脂質(zhì)具有更好的融合促進(jìn)能力，這一點(diǎn)在基因沉默效率上得到了證明。同樣，其中一個(gè)膜不穩(wěn)定理論提出，當(dāng)可電離脂質(zhì)暴露于晚期核內(nèi)體的酸性pH時(shí)，可電離脂質(zhì)與核內(nèi)體膜內(nèi)磷脂之間的靜電相互作用會(huì)導(dǎo)致膜破裂。Liu等最近的一項(xiàng)工作基于這一概念，報(bào)道了利用核磁共振波譜得到的一種新型可電離脂質(zhì)暴露于核內(nèi)體模擬物時(shí)倒置六方相形成的證據(jù)。雖然pH誘導(dǎo)關(guān)聯(lián)是脂質(zhì)材料最常見(jiàn)的機(jī)制，但在我們最近的綜述中討論了其他導(dǎo)致核內(nèi)體膜不穩(wěn)定的路徑。

由于脂質(zhì)相和整體極性的不同，脂膜可能會(huì)捕獲水從而改變膜的流動(dòng)性或變形性，這可能會(huì)影響脂膜融合。膜水合作用也可能影響對(duì)pH的潛在響應(yīng)，而pH通常作為啟動(dòng)核酸釋放的一個(gè)重要環(huán)境誘因。LNP在其生命周期中所涉及的pH波動(dòng)如圖4所示。當(dāng)LNPs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)空間時(shí)，它們被束縛在核內(nèi)體中，而核內(nèi)體在成熟為溶酶體時(shí)會(huì)逐漸酸化。因此，脂質(zhì)膜內(nèi)較高的含水量可能會(huì)影響酸化動(dòng)力學(xué)，并有加速膜的失穩(wěn)。Koitabashi等通過(guò)Laurdan實(shí)驗(yàn)研究了siRNA-LNPs中pH值對(duì)脂膜穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)膜水合作用與基因沉默效率呈正相關(guān)；然而，該研究并未關(guān)注酸化動(dòng)力學(xué)。關(guān)于膜水合有一個(gè)有意思的現(xiàn)象，核磁共振波譜結(jié)果表明，siRNA-LNPs比相同配方的mRNA-LNPs的含水量更少，這可能是因?yàn)橛H水RNA鏈的長(zhǎng)度更長(zhǎng)。Carrasco等進(jìn)一步證明了這些觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)低N/P比的KC2 LNPs單個(gè)納米顆粒中包含更多的mRNA和脂質(zhì)，并且有較高的介電常數(shù)，認(rèn)為低N/P比的LNPs比高N/P比的LNPs更易水合。更高的RNA載量也會(huì)使轉(zhuǎn)染得到改善。因此，mRNA-LNPs可能對(duì)環(huán)境變化更敏感，盡管pH敏感性的變化可能與生物過(guò)程的時(shí)間尺度無(wú)關(guān)。暴露在生物環(huán)境中的重組進(jìn)一步使LNP殼水化的問(wèn)題變得復(fù)雜。

圖4 LNP生命周期中涉及的pH變化

LNPs固有的水環(huán)境也對(duì)其長(zhǎng)期穩(wěn)定構(gòu)成威脅。純核酸在環(huán)境條件下可通過(guò)外源RNase降解或自水解迅速惡化。雖然LNPs可以保護(hù)核酸免受酶降解，但它們?nèi)菀滓驗(yàn)闊崃W(xué)因素（如最小化相分離）聚集，可能導(dǎo)致納米顆粒融合時(shí)核酸的丟失，最終影響轉(zhuǎn)染效率。低溫保存和凍干可以保護(hù)RNA，但是冰結(jié)晶會(huì)損傷LNPs，盡管加入蔗糖等低溫保護(hù)劑似乎可以緩解這個(gè)問(wèn)題。有趣的是，LNPs可能會(huì)根據(jù)儲(chǔ)存條件改變優(yōu)先攝取其的器官，這可能是它們重組的結(jié)果。從實(shí)踐的角度來(lái)看，最近開(kāi)發(fā)的針對(duì)COVID-19的mRNA-LNP疫苗為RNA療法創(chuàng)建了物流基礎(chǔ)設(shè)施，這可能會(huì)消除關(guān)于LNP穩(wěn)定性、存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)脑S多擔(dān)憂。這些疫苗擁有在冷凍溫度（-20°C）下長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的以及室溫下長(zhǎng)達(dá)30天的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，極大地推動(dòng)了這些突破性治療的普及。值得注意的是，輝瑞/BioNTech和Moderna疫苗有著不同的存儲(chǔ)要求，這表明LNP配方的變化可能會(huì)顯著改變其核酸親和力和LNP穩(wěn)定性。由于目前還沒(méi)有建立針對(duì)這些非晶材料的加速穩(wěn)定性測(cè)試的方法，這意味著，LNP穩(wěn)定性只能在離散時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)評(píng)估，差示掃描量熱法（DSC）等方法可能對(duì)LNP退化提供有價(jià)值的參考。最后，預(yù)測(cè)基于LNP的RNA療法的下游特性需要我們對(duì)LNP的自組裝過(guò)程有更深的理解。

圖5 LNP結(jié)構(gòu)待解決問(wèn)題

5.結(jié)論和展望

LNPs是一種高度可定制的核酸載體，在mRNA疫苗中顯示出巨大的潛力。我們也不應(yīng)忽視它們?cè)谥委熀币?jiàn)疾病和癌癥方面的可能價(jià)值。mRNA治療可以幫助產(chǎn)生治療性蛋白來(lái)恢復(fù)受損組織或器官的功能。全球開(kāi)展了大量的科學(xué)研究來(lái)設(shè)計(jì)和細(xì)化LNPs的單個(gè)成分，以便高效和安全地遞送所關(guān)注的核酸。然而，LNP科學(xué)方興未艾，還有許多懸而未決的問(wèn)題，圖5中列出了其中的一些。毫無(wú)疑問(wèn)，公眾對(duì)mRNA疫苗的持續(xù)高漲的興趣將激勵(lì)這一領(lǐng)域的研究工作，我們謹(jǐn)慎樂(lè)觀地認(rèn)為，我們正在見(jiàn)證納米醫(yī)學(xué)的新時(shí)代。

原文來(lái)源：Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery.Acc Chem Res. 2022 Jan 4;55(1):2-12.