Life Med|脂質(zhì)納米顆粒靶向遞送mRNA研發(fā)策略

湃客：Life Medicine 2022-06-28 07:06

針對(duì)近幾年席卷全球的新型冠狀病毒（COVID-19），疫苗研發(fā)一直是布局重點(diǎn)和焦點(diǎn)，被寄予厚望。其中，BNT162b（商品名Comirnaty）和mRNA-1273（商品名Spikevax）兩款mRNA納米疫苗以其極高的保護(hù)效率和研發(fā)速度聞名于世，并迅速引發(fā)國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。目前，以mRNA疫苗為研究熱點(diǎn)的核酸疫苗被視為是繼（減毒）滅活疫苗、亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，正在引領(lǐng)疫苗研發(fā)的潮流，相關(guān)產(chǎn)業(yè)也正如火如荼的進(jìn)行中。“新冠”mRNA疫苗的成功同時(shí)推動(dòng)了全球范圍內(nèi)mRNA的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。 這些事件的背后實(shí)際上是mRNA分子優(yōu)化、體內(nèi)遞送等底層相關(guān)技術(shù)取得的長(zhǎng)足進(jìn)展，特別是在脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）遞送平臺(tái)的突破。一般認(rèn)為，LNPs是遞送mRNA最好的選擇之一，若要擴(kuò)寬mRNA的應(yīng)用場(chǎng)景，研發(fā)靶向遞送LNPs技術(shù)至關(guān)重要。

底層技術(shù)的發(fā)展加速mRNA應(yīng)用

自20世紀(jì)60年代mRNA被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，有關(guān)mRNA的應(yīng)用探索就一刻也不曾停止。mRNA分子具有不穩(wěn)定性、免疫原性、無(wú)法高效進(jìn)入細(xì)胞等特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中非常受限。隨著mRNA分子優(yōu)化技術(shù)、遞送技術(shù)平臺(tái)的不斷發(fā)展，這些缺點(diǎn)正在慢慢地被克服。

其一，mRNA分子優(yōu)化平臺(tái)，包括有：1）序列優(yōu)化的進(jìn)展，如5，3端非翻譯區(qū)序列的篩選、多聚腺嘌呤（poly A）尾巴的長(zhǎng)度優(yōu)化、開放閱讀框（ORF）密碼子的優(yōu)選等；2）核苷酸化學(xué)修飾的引入，如5-甲基尿苷和N1-甲基假尿苷的使用不僅能降低mRNA的免疫原性，還能提高其穩(wěn)定性；3）制備工藝的提升，如體外轉(zhuǎn)錄（IVT）放大工藝的成熟、加帽工序的簡(jiǎn)化、純化和質(zhì)檢方法的穩(wěn)定等。其二，遞送載體平臺(tái)，尤其是LNPs遞送技術(shù)的相對(duì)成熟。一般來(lái)講，LNPs由四種成分組成，每種成分都扮演著相對(duì)重要的角色：可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)被認(rèn)為是LNPs中最重要的成分，它直接決定了mRNA的包裹效率和遞送效率；中性輔助磷脂（如DSPC、DOPE）和膽固醇脂質(zhì)有助于提升LNPs的穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)染效率；聚乙二醇脂（PEG-Lipid）在調(diào)節(jié)LNPs尺寸、穩(wěn)定性、半衰期、遞送效率等方面的作用也十分明顯。值得指出的是，LNPs中單一成分并非獨(dú)自行使功能，各組分之間的配比在mRNA的實(shí)際應(yīng)用中非常重要。

通過(guò)多手段研發(fā)技術(shù)，目前LNPs-mRNA已被應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域，包括疫苗研發(fā)、針對(duì)多種重大疾病的蛋白替代療法、基因編輯療法、細(xì)胞療法等方面。 

LNPs靶向遞送策略擴(kuò)寬mRNA應(yīng)用場(chǎng)景

mRNA精準(zhǔn)遞送是保證治療效果的必要條件之一。針對(duì)體表的組織器官（如肌肉、眼等）可通過(guò)局部給藥方式實(shí)現(xiàn)，而體內(nèi)更深層次器官的遞送則選擇靜脈注射更為合適。靜脈給藥后LNPs介導(dǎo)的肝臟靶向較容易實(shí)現(xiàn)，如何實(shí)現(xiàn)肝外的選擇性遞送則具有挑戰(zhàn)。針對(duì)此科學(xué)問(wèn)題，研究人員嘗試了多種策略，取得了不錯(cuò)進(jìn)展。本亮點(diǎn)文章重點(diǎn)總結(jié)了近期發(fā)表的幾類mRNA靶向遞送策略。

（一）靶向分子修飾

在LNPs表面進(jìn)行靶向分子修飾是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞靶向遞送最直接的方法。Jonathan A. Epstein教授團(tuán)隊(duì)最近利用CD5抗體修飾包裹了CAR mRNA的LNPs，可提高其體內(nèi)靶向T淋巴細(xì)胞的能力。將上述mRNA制劑靜脈注射到心衰小鼠模型后，可在體內(nèi)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行重編程，使其形成有功能的CAR-T細(xì)胞，可以靶向過(guò)度活躍的心臟成纖維細(xì)胞，有效降低了心臟纖維化，并幫助小鼠恢復(fù)了心臟功能。Dan Peer教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)重組融合蛋白（MadCAM-1-D1D2-Fc）修飾LNPs技術(shù)，將mRNA選擇性遞送到特定白細(xì)胞亞群，在結(jié)腸炎小鼠模型中展現(xiàn)出了潛在的治療前景。不同于抗體修飾，Gabriel A. Kwong課題組最近開發(fā)了一種光控的多肽配體置換平臺(tái)，可快速變換修飾到LNPs表面的靶向抗原多肽，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種抗原特異性T細(xì)胞群的靶向mRNA遞送。以上修飾技術(shù)可顯著增強(qiáng)對(duì)特定細(xì)胞類型的靶向遞送能力，但在特異性方面略顯不足。

（二）高通量篩選

上文提到，可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)是LNPs中最重要的成分。通過(guò)結(jié)構(gòu)各異的化學(xué)結(jié)構(gòu)庫(kù)進(jìn)行高通量篩選早已被證實(shí)是研發(fā)靶向LNPs最為有效的方法之一，目前大多數(shù)LNPs是由此技術(shù)研發(fā)產(chǎn)生的，可實(shí)現(xiàn)肝、肺、脾、腦等器官的mRNA遞送,但此方法相對(duì)盲目、工作量大。James Dahlman課題組結(jié)合“DNA條形碼”和深度測(cè)序技術(shù)，開發(fā)了一種新型的高通量篩選技術(shù)，簡(jiǎn)稱為FIND，可顯著提升LNPs的篩選效率。他們將Cre mRNA和特定序列的DNA條形碼包裹到同一個(gè)LNPs中，只需設(shè)計(jì)不同的DNA條形碼就可制備出帶有特定“標(biāo)簽”的一系列LNPs-mRNA藥物。將這些“標(biāo)簽”各異的LNPs通過(guò)靜脈一起注射到Cre誘導(dǎo)表達(dá)tdTom的轉(zhuǎn)基因小鼠中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)tdTom陽(yáng)性細(xì)胞，并結(jié)合DNA深度測(cè)序的方法可鑒別出特定細(xì)胞靶向的LNPs載體。通過(guò)該體系，他們可同步篩選超200種LNPs，顯著提高了LNPs的篩選效率。

（三）可預(yù)測(cè)性LNPs優(yōu)化

區(qū)別于高通量篩選，如果給出明確的LNPs設(shè)計(jì)原則，則會(huì)大大縮短研發(fā)周期，提高研發(fā)效率。Daniel Siegwart課題組2020年在Nature Nanotechnology上報(bào)道了一種可預(yù)測(cè)性設(shè)計(jì)的LNPs研發(fā)技術(shù)，命名為SORT。在原有4組分LNPs基礎(chǔ)上，僅添加一種帶有不同電荷的新脂質(zhì)分子（SORT分子），則可實(shí)現(xiàn)mRNA在小鼠的肝臟、脾臟、肺部的靶向遞送和基因編輯。通過(guò)增加陽(yáng)離子脂質(zhì)能夠使mRNA特異遞送進(jìn)入肺部；陰離子脂質(zhì)能夠使mRNA特異進(jìn)入脾臟；而可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)則會(huì)增強(qiáng)肝臟的靶向遞送。重要的是，SORT技術(shù)具有普適性，可在多種類型的LNPs基礎(chǔ)上快速研發(fā)出肝外器官靶向LNPs。進(jìn)一步機(jī)制探究發(fā)現(xiàn)，SORT分子可調(diào)控SORT-LNPs在器官水平的生物分布、LNPs自身pka、及表面血清蛋白冠等，這些因素最終決定了LNPs在體內(nèi)的靶向遞送能力。文中指出，在器官靶向遞送方面，LNPs表面的血清蛋白冠起到最關(guān)鍵作用，識(shí)別這些獨(dú)特的蛋白質(zhì)可能會(huì)在未來(lái)研發(fā)靶向其他器官的LNPs方面有所幫助。

圖1. 體內(nèi)靶向遞送mRNA-LNPs的研發(fā)策略。

總結(jié)與展望
器官選擇性遞送對(duì)于拓寬mRNA臨床應(yīng)用至關(guān)重要。本文提到的幾種代表性策略在一定程度上提出了解決方案，但各有不足之處。如何開發(fā)出靶向其他重要器官（如心臟、胰腺、腎臟）的LNPs、如何實(shí)現(xiàn)對(duì)特定臟器中特定細(xì)胞類型的靶向遞送都是未來(lái)需要解決的重要問(wèn)題。隨著研究人員對(duì)mRNA靶向遞送技術(shù)的深入研究，相信未來(lái)會(huì)有更多的靶向遞送策略研發(fā)出來(lái)用于精準(zhǔn)醫(yī)療研究。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac004